Development and validation of PCR-based assays for diagnosis of American cutaneous leishmaniasis and identificatio nof the parasite species

In this study, PCR assays targeting different Leishmania heat-shock protein 70 gene (hsp70) regions, producing fragments ranging in size from 230-390 bp were developed and evaluated to determine their potential as a tool for the specific molecular diagnosis of cutaneous leishmaniasis (CL). A total of 70 Leishmania strains were analysed, including seven reference strains (RS) and 63 previously typed strains. Analysis of the RS indicated a specific region of 234 bp in the hsp70 gene as a valid target that was highly sensitive for detection of Leishmania species DNA with capacity of distinguishing all analyzed species, after polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorfism (PCR-RFLP). This PCR assay was compared with other PCR targets used for the molecular diagnosis of leishmaniasis: hsp70 (1400-bp region), internal transcribed spacer (ITS)1 and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6pd). A good agreement among the methods was observed concerning the Leishmania species identification. Moreover, to evaluate the potential for molecular diagnosis, we compared the PCR targets hsp70-234 bp, ITS1, G6pd and mkDNA using a panel of 99 DNA samples from tissue fragments collected from patients with confirmed CL. Both PCR-hsp70-234 bp and PCR-ITS1 detected Leishmania DNA in more than 70% of the samples. However, using hsp70-234 bp PCR-RFLP, identification of all of the Leishmania species associated with CL in Brazil can be achieved employing a simpler and cheaper electrophoresis protocol.

PCR-RFLP mkDNA no diagnóstico e identificação das espécies de Leishmania causadoras de Leishmaniose cutânea no Brasil / PCR-RFLP mkDNA in the diagnosis and identification of Leishmania species causing cutaneous leishmaniasis in Brazil

Neste trabalho estudamos a aplicabilidade e a capacidade da PCR-RFLP mkDNA na identificação e diferenciação de espécies de Leishmania que circulam no Brasil. Esta técnica diferencia-se das outras PCRs seguidas de restrição no produto de amplificação, por utilizar como alvo a região conservada dos minicírculos de kDNA das leishmânias. Inicialmente, testamos a técnica num conjunto de amostras que haviam sido previamente caracterizadas por hibridização com sondas radioativas, de uma região endêmica para Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) onde apenas L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis haviam sido encontradas. A comparação dos resultados obtidos com a PCR-RFLP mkDNA e hibridização foram 91,5 por cento concordantes, mostrando que a técnica apresentava potencial para ser usada diretamente em material clínico. Em seguida, testamos a capacidade da PCR-RFLP mkDNA em diferenciar, também, as espécies L. (V.) guyanensis, L. (V.) shawi, L. (V.) naiffi, L. (V.) lainsoni e L. (L.) chagasi, todas presentes no Brasil. Para isto, fizemos um mapa de restrição nas seqüências de DNA da região conservada dos minicírculos de Leishmania depositadas no GenBank e testamos a PCR-RFLP mkDNA em cepas referência destas espécies e em 23 isolados de Leishmania de diferentes zimodemas, que confirmaram a identidade dos parasitos. Propomos um esquema de diferenciação que contempla a maioria das espécies de Leishmania presentes no Brasil, entretanto, não conseguimos diferenciar L. (V.) braziliensis de L. (V.) guyanensis. A partir destes resultados partimos para a aplicação da metodologia em dois conjuntos de amostras clínicas. No primeiro conjunto, testamos a PCR-RFLP mkDNA na identificação de Leishmania em amostras da região endêmica para LTA do Vale do Rio Doce - MG. Os parasitos foram extraídos de uma amostra de 475 lâminas coradas pelo Giemsa, arquivadas entre 1965-2000. A PCR-RFLP mkDNA foi positiva em 395 (83,2 porcento) laminas e L. (V.) braziliensis a única espécie presente na amostra. No segundo conjunto, avaliamos o uso da PCR-RFLP mkDNA na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA de diferentes áreas endêmicas do Brasil em amostras clínicas de 329 pacientes, de 6 estados do Brasil, preservadas de diversas formas. Independente da forma de preservação, a PCR-RFLP mkDNA detectou e identificou L. (V.) braziliensis (89,0 por cento), L. (L.) amazonensis (6,4 por cento) e L. (V.) lainsoni (4,6 por cento) nas amostras clínicas. Por ser uma técnica muito sensível, de rápida execução, de fácil leitura, confirmar as caracterizações dos parasitos feitas previamente por outros métodos, sugerimos a utilização da PCR-RFLP mkDNA como um método alternativo na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA no Brasil.

PCR-RFLP mkDNA no diagnóstico e identificação das espécies de Leishmania causadoras de Leishmaniose cutânea no Brasil / PCR-RFLP mkDNA in the diagnosis and identification of causing species of Leishmania of Leishmaniasis cutaneous in Brazil

Neste trabalho estudamos a aplicabilidade e a capacidade da PCR-RFLP mkDNA na identificação e diferenciação de espécies de Leishmania que circulam no Brasil. Esta técnica diferencia-se das outras PCRs seguidas de restrição no produto de amplificação, por utilizar como alvo a região conservada dos minicírculos de kDNA das leishmânias... Em seguida, testamos a capacidade da PCR-RFLP mkDNA em diferenciar, também, as espécies L. (V.) guyanensis, L. (V.) shawi, L. (V.) naiffi, L. (V.) lainsoni e L. (L.) chagasi, todas presentes no Brasil. Para isto, fizemos um mapa de restrição nas seqüências de DNA da região conservada dos minicírculos de Leishmania depositadas no GenBank e testamos a PCR-RFLP mkDNA em cepas referência destas espécies e em 23 isolados de Leishmania de diferentes zimodemas, que confirmaram a identidade dos parasitos. Propomos um esquema de diferenciação que contempla a maioria das espécies de Leishmania presentes no Brasil, entretanto, não conseguimos diferenciar L. (V.) braziliensis de L. (V.) guyanensis. A partir destes resultados partimos para a aplicação da metodologia em dois conjuntos de amostras clínicas. No primeiro conjunto, testamos a PCR-RFLP mkDNA na identificação de Leishmania em amostras da região endêmica para LTA do Vale do Rio Doce - MG. Os parasitos foram extraídos de uma amostra de 475 lâminas coradas pelo Giemsa, arquivadas entre 1965-2000. A PCR-RFLP mkDNA foi positiva em 395 (83,2 por cento) laminas e L. (V.) braziliensis a única espécie presente na amostra. No segundo conjunto, avaliamos o uso da PCR-RFLP mkDNA na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA de diferentes áreas endêmicas do Brasil em amostras clínicas de 329 pacientes, de 6 estados do Brasil, preservadas de diversas formas. Independente da forma de preservação, a PCR-RFLP mkDNA detectou e identificou L. (V.) braziliensis (89,0 por cento), L. (L.) amazonensis (6,4 por cento) e L. (V.) lainsoni (4,6 por cento) nas amostras clínicas. Por ser uma técnica muito sensível, de rápida execução, de fácil leitura, confirmar as caracterizações dos parasitos feitas previamente por outros métodos, sugerimos a utilização da PCR-RFLP mkDNA como um método alternativo na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA no Brasil.

PCR-RFLP mkDNA no diagnóstico e identificação das espécies de Leishmania causadoras de Leishmaniose cutânea no Brasil

Neste trabalho estudamos a aplicabilidade e a capacidade da PCR-RFLP mkDNA na identificação e diferenciação de espécies de Leishmania que circulam no Brasil. Esta técnica diferencia-se das outras PCRs seguidas de restrição no produto de amplificação, por utilizar como alvo a região conservada dos minicírculos de kDNA das leishmânias. Inicialmente, testamos a técnica num conjunto de amostras que haviam sido previamente caracterizadas por hibridização com sondas radioativas, de uma região endêmica para Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) onde apenas L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis haviam sido encontradas. A comparação dos resultados obtidos com a PCR-RFLP mkDNA e hibridização foram 91,5 porcento concordantes, mostrando que a técnica apresentava potencial para ser usada diretamente em material clínico

Em seguida, testamos a capacidade da PCR-RFLP mkDNA em diferenciar, também, as espécies L. (V.) guyanensis, L. (V.) shawi, L. (V.) naiffi, L. (V.) lainsoni e L. (L.) chagasi, todas presentes no Brasil. Para isto, fizemos um mapa de restrição nas seqüências de DNA da região conservada dos minicírculos de Leishmania depositadas no GenBank e testamos a PCR-RFLP mkDNA em cepas referência destas espécies e em 23 isolados de Leishmania de diferentes zimodemas, que confirmaram a identidade dos parasitos. Propomos um esquema de diferenciação que contempla a maioria das espécies de Leishmania presentes no Brasil, entretanto, não conseguimos diferenciar L. (V.) braziliensis de L. (V.) guyanensis. A partir destes resultados partimos para a aplicação da metodologia em dois conjuntos de amostras clínicas.No primeiro conjunto, testamos a PCR-RFLP mkDNA na identificação de Leishmania em amostras da região endêmica para LTA do Vale do Rio Doce - MG. Os parasitos foram extraídos de uma amostra de 475 lâminas coradas pelo Giemsa, arquivadas entre 1965-2000. A PCR-RFLP mkDNA foi positiva em 395 (83,2 porcento) laminas e L. (V.) braziliensis a única espécie presente na amostra. No segundo conjunto, avaliamos o uso da PCR-RFLP mkDNA na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA de diferentes áreas endêmicas do Brasil em amostras clínicas de 329 pacientes, de 6 estados do Brasil, preservadas de diversas formas. Independente da forma de preservação, a PCR-RFLP mkDNA detectou e identificou L. (V.) braziliensis (89,0 porcento), L. (L.) amazonensis (6,4 porcento) e L. (V.) lainsoni (4,6 porcento) nas amostras clínicas. Por ser uma técnica muito sensível, de rápida execução, de fácil leitura, confirmar as caracterizações dos parasitos feitas previamente por outros métodos, sugerimos a utilização da PCR-RFLP mkDNA como um método alternativo na detecção e identificação dos agentes etiológicos da LTA no Brasil